到目前为止，美国和欧盟已经先后批准了两种CAR-T细胞疗法，分别是诺华公司与宾夕法尼亚大学合作开发的用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的Kymriah(CTL 019)和吉利德子公司Kite Pharmaceutical开发的用于治疗成人复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)的Yescarta。
尽管CAR-T的安全性和有效性已经得到了很好的验证，但由于产品的异质性、制造的复杂性以及缺乏标准化的全球监管，CAR-T仍然是一种仅限于数百名患者的精品疗法。
实现CAR-T的规模化生产是提高其可达性的重要问题。因此，各国对CAR-T的制造和法规进行标准化是势在必行且富有挑战性的。
近日，江南大学戴小枫教授和解放军总医院韩卫东教授作为共同通讯作者，在《生物技术进展》(SCI I，IF=11.452)发表了一篇题为“规范Car-T疗法：使其规模化”的文章，围绕限制CAR-T生产规模的问题，对现状进行了评述
标准化CAR-T制造
工程化T细胞的临床制备首先需要采集患者外周血单核细胞，进行增殖，然后进行基因修饰和扩增，并在输注前进行筛选和/或冻存。鉴于CAR-T原料的多样性和现有的各种培养技术，修饰T细胞的最终质量变化仍是一个需要解决的重要问题。
戴小枫教授和韩卫东教授指出，以下七个因素的标准化对大规模CAR-T生产的成功具有决定性作用：制造工艺、原材料、病毒载体、辅助试剂、质量控制、处理后的免疫监测以及政府监管。
制造过程
制造过程应追求(1)生产安全和临床有效的细胞产品；(2)可扩展性，在不牺牲产品质量和可复制性的前提下，让更多的患者从这些技术中受益。
为了实现这一目标，本文提出了封闭的自动化系统和质量设计的概念。
封闭式自动化系统
封闭培养系统是防止产品污染和保持无菌环境的可靠策略。为此，可将关键试剂的生产程序纳入一个封闭系统，或建立良好的跟踪供应链和技术，使原料生产在一个封闭系统中完成。
从细胞制备、筛选、培养、扩增、转导到配方，自动化在标准化生产过程中具有特殊用途。目前已经有一些公司建立了相应的技术平台。
几种汽车制造平台的比较
-中国生物技术公司博雅生命搭建CAR-TX Press平台，集临床细胞分离、纯化、培养、洗涤、配制于一体。这是一个紧凑的单元操作装置。
-CliniMACS Prodigy由德国Miltenyi Biotec公司自主研发，是集细胞分选、扩增、转导、培养等功能于一体的高度自动化临床级细胞制备平台，提供由多个功能模块组成的集成系统。
但是，它的使用受到一些缺点的限制，如成本高，在长期细胞培养过程中其他功能部件不可用，以及需要定制供应商设计软件。
-瑞士CDMO巨头龙沙(Lonza)与Octane Biotech合作开发了自动生物反应器Co-coon，这是一个由多个集成单元组成的高通量系统，可以以可定制规模的高通量方式并行处理源细胞，被称为GMP-in-a-box系统。
QbD
QB从所需产品质量属性的描述开始，直接确定影响产品安全性和有效性的特性和相关参数，为量化参数变异创造设计空间。通过将科学知识和风险分析融入到制造工艺的开发中，QbD可以识别合适的作业包络线，并通过知识的增加对其进行迭代修改，从而生产出高质量的产品。
鉴于CAR-T产品的异质性和产品质量的不确定性，如何将细胞群体可测量的分子和细胞特征与产品质量联系起来，将决定CAR-T制造和QbD的成败。
原料
CAR-T的原料是高度可变的患者细胞，通常来自接受放疗和化疗的患者，这决定了细胞中可能含有不同水平的抑制因子或抵抗刺激的T细胞亚群。这些因素对制造过程的可重复性提出了挑战。
目前，有两种策略可以解决这一挑战。首先，从T细胞中去除抑制性成分。已有报道通过几种方法去除这些抑制性元件后T细胞培养的改善结果，如：(1)同时使用两种细胞表面标志物CD44和CD137分离抗肿瘤CD4 T细胞，耗尽抑制性调节性T细胞群(Treg细胞)；(2)使用涂有抗CD3和抗CD28的大磁珠和适用于袋子的大磁体代表了结合隔离和刺激的强大制造工艺。
其次，确定的T细胞亚群被用作起始材料。T细胞的特定亚群，即记忆干细胞，已被证明可提供改善的临床效果，并被视为良好的起始材料。例如，抗巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒的内源性抗原反应性记忆T细胞已被用作基因工程的来源T细胞，因为具有抗原特异性的记忆T细胞有利于预防病原体，因为它们在淋巴细胞清除和预防CAR-T后病毒再活化方面具有良好的效果
病毒载体
病毒用于将CAR转移到T细胞的过程中，被认为是美国CAR-T细胞制造过程的关键原料。与高度异质性和个性化的血液样本和CAR-T细胞终产物不同，病毒载体可以大量生产，并在-80下稳定储存4至9年。
通常，批量生产用于细胞治疗的病毒载体需要2周以上的时间，大部分时间都花在生产足够的细胞上。将细胞培养并扩增数天至合适的量，然后进行质粒转染以产生病毒载体。病毒应该具有防止它们重新获得复制能力的特征。密码子优化的Gag/Pol可以最小化载体成分之间的同源性，自我灭活长末端重复，去除所有不必要的序列和辅助基因，这些都是防止这个问题的标准设计。
转染后48小时内，可从培养基中收获表达CAR的病毒载体，通过更换培养基可收获多批病毒载体。过滤产生的细胞和片段后，通过一系列下游处理纯化病毒载体，并用储存缓冲液富集。
载体的质量，包括无菌性和纯度(即缺乏包装细胞)、效力、身份和滴度，对最终CAR-T产品的成功至关重要。正因如此，它需要在GMP设施中的受控条件下制造，并进行最小限度的开放式处理，然后进行一系列安全性测试，以确保每批载体产品都符合标准，然后才能用于T细胞转导。
根据FDA指南，安全性测试涉及“细胞特性测试”，即通过一系列表型和/或生化测试来评估细胞特性和异质性。“效能测试”评估CAR-T产品的功能；“活力测试”量化细胞活力；“无菌试验”验证细胞未被外来物质污染，如细菌、真菌、支原体和病毒；“纯度测试”确保产品不含残留宿主细胞和质粒DNA，避免工艺相关杂质；“一般安全性试验”评估最终产品临床应用的安全性，随后的“批放行试验”适用于给药前解冻冷冻细胞。
当整合病毒载体用于细胞转导时，需要额外的测试来检查细胞和培养基中是否存在复制逆转录病毒/慢病毒(RCRs/RCLs ),以帮助确定用于输注给患者的最终CAR-T产品的安全性。细胞转导载体的选择和优化对于减少大规模CAR-T制造的可变性和最大化最终产品的效率是非常重要的。常用的载体是基于逆转录病毒和慢病毒的复制缺陷型载体系统。慢病毒载体保留了感染非分裂细胞的能力，因此它们提高了转导效率。第三代慢病毒载体因其体积大大减小(由一组HIV基因构建)和安全性增强(在载体产生细胞外无功能)而进一步受到青睐。
当使用病毒载体时，应监测生产、收集和纯化步骤，并应提供提供载体的制造商的详细信息。整合所有载体的一个潜在问题是由载体DNA整合到宿主细胞癌基因附近引起的插入突变。在这方面，慢病毒载体优于逆转录病毒载体，因为它们的整合方式有利于远离基因启动子的位点。其他因素如编码转基因、启动子、细胞类型和适应症也与插入诱变有关。
如果载体产品中存在RCR/RCL，会增加致癌可能性。因此，在载体制造的全过程和细胞产品的载体改造的多个阶段，都需要进行严格的RCR/RCL测试。
FDA建议对使用病毒载体的细胞和基因治疗进行长期安全性评估。例如，一项美国试验已经在进行中，对接受CTL019治疗的患者进行了15年的随访(NCT02445222)。其主要目标是监测与使用病毒载体相关的延迟不良事件。
非病毒载体
基于mRNA、DNA和转座子/转座酶的电穿孔系统显示了有效转导T细胞的前景，解决了与使用病毒载体相关的一些问题，如安全性问题、大规模生产和复杂的操作步骤。
使用非病毒方法进行转导时，应严格控制mRNA或DNA质粒的质量，试剂应为临床级，电穿孔装置应适合临床使用。
然而，非病毒转座子系统可能需要长期体外扩增才能达到CAR T细胞的治疗剂量，这极大地限制了其临床应用。目前，已经提出了几种解决这个问题的方法。例如，非病毒睡美人(SB)转座CAR基因来自一个最小化的DNA载体(即小环)，而不是传统的SB质粒，可以显著提高稳定的基因转移率和细胞活力，以满足临床CAR T细胞的生产需求。
辅助试剂
体外操作中所用试剂的质量，如抗体、细胞因子、血清或固体支持物(如珠子)，可能会显著影响最终CAR-T产品的安全性、纯度和功效。
所有试剂必须遵循USP关于辅助材料的建议。特别是，鉴于制造过程的高度可变性，应限制使用天然来源的物质。例如，培养基应该是无血清的，以降低被牛海绵状脑病(BSE)或病毒污染的风险。如果不可能，应提供确认血清必要性的文件。同样，其他添加剂，如细胞因子和抗生素，也建议清除。如果它们都不适用，那么它们应该有精确的化学定义，具有临床级别，并且没有内毒素和意外污染。
这些添加的成分需要有效且稳定地一起工作，以形成整合的试剂系统。理想情况下，这种制备系统使制造过程足够稳健，能够从患者身上生产出合格的细胞产品。
质量控制
CAR-T产品的安全性、纯度、特性和功效构成了其关键的质量属性。鉴于其高度异质性和复杂的制造工艺，个体化治疗对这些属性的要求远高于普通药品。因此，CAR-T产品必须经过多次质量控制分析，以符合所有公布的标准和良好生产规范(GMP)指南。
转导效率
转导效率(CAR阳性T细胞的百分比)是确定CAR-T细胞在体内效果的重要参数。目前，指南要求通过流式细胞仪或大肠杆菌来确定转导效率
理论上，通过将抗生素抗性基因整合到CAR载体中，然后选择具有相应抗生素的阳性细胞，产生纯的CAR阳性T细胞是可行的。但由于其在CAR-T产品上存在复杂的安全性问题，不适合临床应用。
因此，细胞产品中是否存在最优的CAR-T细胞群体仍不确定，需要科学界寻找并制定可行的标准，政府主管部门出台相应的控制转导效率的指南。
生物学效力
CAR-T细胞的生物学功效需要在输注前确定，常用的指标是CAR-T细胞的裂解活性。免疫检查点，如PD-1和CTLA-4，已显示抑制CAR-T细胞的功效，但它们不包含指南中确定的功效控制阈值。
由于体外和体内CAR-T效价存在差异，CAR-T细胞的修饰增加了释放试验的复杂性，因此需要制定一个标准方案来全面评估CAR-T细胞的体外生物学功能：确定改变CAR-T细胞生物学效价的分子的表达水平，并建立一个公认的通用技术来控制CAR-T细胞的生物学效价。
毒性
毒性是CAR-T产品临床应用的重要考虑因素。研究人员应提供全面和详细的毒性评估标准，包括毒性等级分类(“靶向”、“靶向、o-肿瘤”、“o-target'”)和每个等级的详细策略。
除了在质量控制中详细说明毒性外，在进行CAR-T治疗时，还应考虑患者护理，如制备免疫抑制药物以防止细胞因子释放综合征和其他严重不良反应的发生。
与传统的医疗产品相比，CAR-T细胞的质量控制过程在可用材料的数量和检测时间点的选择上有更多的局限性。因为这些产品在输注或冷冻保存前保质期有限，所以也必须及时检测。
自动化
自动化有助于标准化质量控制方案：自动染色、收集和分析将有利于培养细胞群体的流式细胞术分析，如MACSQuant分析仪和分析工具；流量数据的自动获取和分析，有助于快速生成标准化报告，大幅减少工作量，如LIMS(实验室信息与管理系统)；自动跟踪和批次记录可以促进质量控制，其中有效的跟踪需要覆盖整个制造过程，即从材料取样开始到患者输液。在过程中与质量控制系统的紧密联系中，需要建立自动批次记录，这使得高度标准化的个性化方案在每个制造过程结束时得以推广，以便比较不同生产现场和不同过程的质量控制数据，促进我们对细胞产品的了解。
然而，虽然目前有许多选项可以自动化CAR-T(“制造过程”)的一些步骤，但自动化整个过程的设备相对较少。因此，为了创造一个最大限度减少人为干预且易于使用的封闭环境，开发一个覆盖整个生产过程的制造系统是必要且具有挑战性的。此外，细胞样本自动分析的监管协议可以使自动化过程中的决策成为可能，从而实现细胞治疗产品的自动化质量控制，但目前仍有所欠缺。
简而言之，质量控制对CAR-T疗法的成功至关重要。有必要建立一个由公认的准则管理的标准化质量控制框架，并开发尽可能少外部干预的自动化设备，以帮助实现这一目标。
治疗后免疫监测
与传统的现成药物不同，监测CAR-T细胞的过继转移以阐明和提高其生物活性是非常重要的。目前，监测的重点是评估CAR-T细胞的频率和表型，内源性免疫反应的变化，炎症细胞因子的水平，肿瘤抗原的表达和微环境。
CAR-T的大规模应用和患者随访涉及高通量和多重分析技术，包括TCR测序、基因表达平台、多质谱细胞计数方法和多通道微珠免疫分析。PET成像和其他新兴方法尚未应用于CAR-T细胞反应的评估
在全球范围内，标准化和协调的监测分析可以使不同地点的机构、公司和医院之间的结果具有可比性，从而产生大量的免疫监测信息，这将有助于促进CAR-T的进一步发展。
政府监管
截至目前，全球已注册近300个CAR-T临床试验(不包括试验终止或取消)，美国107个，中国130个。鉴于其独特的功能和来源，任何传统的‘现成’药物都不能代表CAR-T产品。无论是基因治疗还是细胞治疗，都需要遵循他们的任何指南和管理规范，尤其是已经公布的关于CAR-T细胞的文件。
美利坚合众国
在美国，FDA将CAR-T细胞分类为351种生物产品，并通过“细胞和基因治疗产品早期临床试验设计的考虑因素”和“工业指南：研究性细胞和基因治疗产品的临床前评估”。
此外，CAR-T产品应遵循指南“FDA审查者和申办者指南：人体细胞治疗研究新药申请(inds)的化学、生产和控制(CMC)信息的内容和审查”和“FDA审查者和申办者指南：新药申请(INDs)中人体基因治疗研究的化学、生产和控制(CMC)信息的内容和审查”，其中详细描述了CAR-T细胞的生产、过程控制、放行测试和质量控制。
为了加快医疗产品的开发，并为有需要的患者提供更有效的治疗，美国政府于2016年12月发布了《21世纪治愈法》(21st Century Cures Act)，以简化药物和设备的审批流程，更快地提供临床治疗。美国政府已经授权5亿美元帮助FDA在9年内实施这项法律。在此基础上，建立了新的加速产品开发计划，包括“再生医学高级治疗(RMAT)”和“突破性医疗器械项目”，为符合覆盖范围的生物制品或设备(包括CAR-T和CAR-T相关设备)提供新的加速选项。
欧洲
在欧洲，医疗管理由欧洲药品管理局(EMA)监管，适用于监管CAR-T产品的指南是“关于含有转基因细胞的医药产品的质量、非临床和临床方面的指南”，该指南定义了科学原则，并为开发和评估含有经授权的转基因细胞的人用药品提供了指导，重点关注细胞产品的质量、安全性和有效性。此外，CAR-T细胞的制造应遵循高级治疗药物的规定(第1394/2007号)和基因转移药物的质量、临床前和临床方面的指南(CPMP/BWP/3088/99)。
与FDA发布的指南不同，EMA有专门的文件将转基因细胞作为医疗产品进行监管。
中国
而标准化制造代表了安全性更高、价格更低的产品。因此，在发展中国家实施CAR-T产品的规范性法规是特别有益和实用的，因为它们通常拥有较少的自动化“个性化车间”。
在中国，第一个有助于规范CAR-T产品临床研究的指南是1993年国家卫生计生委发布的《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》。
后来，中国食品药品监督管理局(NMPA)发布了一系列基因和细胞治疗的监管指南。2003年，NMPA发布了《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，明确了临床试验需要考虑的医疗产品的基本要求，将携带功能基因的转基因细胞和载体指定为医疗产品。同年NMPA发布的另一个CAR-T产品指南是《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》。
此外，CAR-T产品还受临床试验中使用的药物的一般指南，即NMPA于2003年8月发布的《临床试验用药物生产质量管理规范》的管制。国家卫生和计划生育委员会于2015年发布了干细胞临床试验监管指南，即“限制医疗技术的临床应用”。NMPA于2017年12月22日发布《细胞治疗产品研究与评价指导原则》(审2017第216号)。
虽然出台了很多规定，但是为了安全起见，CAR-T细胞还是有一些独有的特点需要规范。然而，这些特性，如转导效率，目前在中国没有任何监管指南涉及。预计CAR-T细胞的行政文件规范将于近期发布。
为整个CAR-T行业制定广泛接受的指南是一项挑战，因为不同表型或生产方法的CAR-T细胞通常会产生相同的效果。因此，良好的指南应确保CAR-T产品的安全性和有效性，使其制造透明和标准化，并描述生产、工艺放行测试和认证分析的最低和基本标准。
另一方面，一些决定CAR-T产品效率和安全性的因素，如果不作为政府指南发布，则需要作为建议发布，以帮助保证和提高CAR-T产品的质量。例如，预处理通常包括非清髓性化疗方案，去除抑制抗肿瘤活性的各种抑制剂，这应考虑纳入未来指南更新。其他因素，如修饰T细胞的活力、表型、无菌性、同质性和遗传稳定性，以及每个细胞的基因拷贝数也可以在指南中提出。
目前，一些国家已经发布了CAR-T细胞临床试验的国内指南，不同国家的监管机构之间交换指南是常见的，例如FDA和EMA之间以及FDA和CFDA之间。
为了在全球范围内实现临床试验，需要协调各国的监管指南。全球药品监管机构的九个成员，包括FDA、EMA、加拿大卫生部、巴西ANVISA、印度国家生物制品研究所(INB)、日本卫生福利和劳工/药品和医疗器械局、韩国食品和药品安全部、新加坡卫生科学局(HSA)和Swissmedic，召开了一次论坛，讨论细胞或基因治疗监管的最佳监管方案(therapy-workinggroup/)。在统一的法规制定之前，CAR-T产品的发展还存在很大的不确定性，很大程度上取决于监管者的主观判断。
专家点评
评论：
细胞治疗已成为许多疾病，尤其是肿瘤治疗的重要手段。从细胞培养设备、使用的试剂、给药途径、监管法律等方面，已经初步具备了药性的各种条件，国际上也有官方批准的适合个体化治疗的细胞药物，大规模的标准细胞生产和制备是细胞药性的前提和必要条件。戴小枫教授从多个质量控制环节的角度阐述了大规模细胞制备中需要控制的几个关键要素和实施原则，有助于理解和进一步优化细胞制备各个环节和链条的有序形成。
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