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CRISPR技术有助于治疗杜氏肌营养不良

2023-03-15 责任编辑:未填 浏览数:10 天涯医药网

核心提示:在接下来的一年里,研究人员测量了有多少肌肉细胞被成功编辑,发生了什么类型的基因变化,以及针对细菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫反应的发生。”因此,这项新研究的目的是探索可能改变基于CRISPR/Cas9的基因编辑的长期影响的因素。。

杜克大学的研究人员通过对小鼠长达一年的研究,证明了CRISPR基因组编辑技术可以安全稳定地纠正一种叫做杜氏肌营养不良症(DMD)的遗传性疾病。这项研究于2月18日在线发表在期刊《Nature Medicine》上。

2016年,杜克大学鲁尼家族生物医学工程副教授查尔斯格斯巴赫(Charles Gersbach)发表了利用CRISPR治疗遗传性疾病动物模型的成功方法,其策略可能会转化为人类疗法。自那以后,许多其他案例被发表,更多针对人类疾病的基因组编辑疗法目前正在临床试验中。

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格斯巴赫的最新研究集中在DMD的小鼠模型上,DMD是由身体无法产生dystrophin引起的。肌营养不良蛋白链是一条长蛋白质链,它将肌肉纤维的内部与周围的支持结构结合在一起。

肌萎缩蛋白由一个包含79个蛋白编码区的基因编码,该基因称为外显子。如果基因突变破坏或删除了一个或多个外显子,链就建不起来,导致肌肉慢慢撕裂变质。大部分患者10岁就要坐轮椅了,不可能过20,也不可能30出头。

自2009年以来,格斯巴赫一直致力于杜氏病的潜在遗传疗法。他的实验室是最早关注CRISPR/Cas9的实验室之一,CRISPR/cas 9是细菌防御系统的改良版,可以定位并切割入侵病毒的DNA。他的方法使用CRISPR/Cas9来切割基因突变周围的dystrophin外显子,并让身体的天然DNA修复系统将剩余的基因缝合在一起,以创建一个缩短但有功能的dystrophin基因。

“一般认为基因编辑会导致永久性的基因改变,”格斯巴赫说。“然而,探索可能破坏基因编辑效果的理论可能性是非常重要的。”因此,这项新研究的目的是探索可能改变基于CRISPR/Cas9的基因编辑的长期影响的因素。

领导这项工作的Gersbach实验室博士后研究员Christopher Nelson给携带缺陷性dystrophin基因的成年和新生小鼠静脉注射了单剂量的CRISPR疗法。在接下来的一年里,研究人员测量了有多少肌肉细胞被成功编辑,发生了什么类型的基因变化,以及针对细菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫反应的发生。

其他研究报告称,小鼠的免疫系统可以对Cas9做出反应,这可能会干扰CRISPR疗法的益处。一些研究小组还报告说,一些人对Cas9蛋白具有预存免疫力,这可能是由于以前与细菌宿主接触。“好消息是,尽管我们观察了抗体和T细胞对Cas9的反应,但似乎它们都没有在这些小鼠中产生任何毒性,”作者说。“这种反应并没有阻止该疗法成功编辑肌营养不良蛋白基因并产生长期的蛋白质表达。”

但作者承认,小鼠免疫系统的功能通常与人类免疫系统完全不同。目前,新生儿DMD筛查尚未广泛开展;大多数杜兴氏诊断发生在儿童3至5岁时。为了应对这一挑战,格斯巴赫表示,在治疗过程中抑制免疫系统的活动可能是一种可行的方法。

此外,研究人员还在研究仅在短时间内限制Cas9向肌肉细胞表达或递送的潜在策略,这可能会降低免疫检测。

作者之前研究了CRISPR/Cas9的脱靶编辑潜力,无意中修改了基因组中的其他位点,并报告了可能的脱靶位点的最小活性。然而,最近的其他研究报告称,CRISPR有时可以在正确的位点进行基因编辑,但不是以预期的方式。例如,一些研究表明,CRISPR可以切下比预期大得多的基因切片,或者可以在切割位点嵌入DNA片段。这些类型的编辑在以前的基因组编辑研究中没有报道,因为使用的方法只检测预期的编辑。

为了全面定位dystrophin基因中的所有编辑,作者进行了DNA测序。令人惊讶的是,除了预期的靶外显子缺失,还发生了许多类型的编辑,包括来自编码CRISPR/Cas9系统的病毒载体的高度插入的DNA序列。

根据组织的类型和CRISPR的剂量,多达一半的目标编辑会导致这些替换序列发生变化。虽然这一结果令人惊讶,但意想不到的序列变化似乎并不影响CRISPR/Cas9基因编辑方法用于DMD的安全性或有效性。

“由于dystrophin基因已经存在缺陷,在这种情况下,这些编辑情况可能不会引起关注。尽管如此,任何意想不到的结果都可能剥夺你试图实现的基因编辑的效率,这支持了在未来的研究中设计客观识别和减轻替代编辑的方法的重要性。”

“以前的研究表明,其中一些类型的编辑可能会发生,但这是首次使用治疗相关方法在动物模型中全面测量这些事件之一。展望未来,我们需要仔细监测这一现象,并更好地理解它。避免这些替代编辑,增加方法编辑的预期频率,以最大限度地发挥基因组编辑在治疗疾病方面的潜力,这非常重要。”

来源:DMD:单一crispr治疗为小鼠提供长期益处

来源:Christopher e. Nelson等人对杜兴肌营养不良症AAV-克里斯普基因组编辑的长期评估。自然医学,2019;DOI: 10.1038/s41591-019-0344-3

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