灭鼠药和华法林的故事流传了半个多世纪。作为世界上最畅销的杀鼠剂和应用最广泛的抗凝血剂，它的故事本身就是一个传奇。本文将跟随卡尔保罗林克(Karl Paul link)教授的脚步，体验其背后的未知。
前言
故事开始于1923年。在美国北达科他州和加拿大阿尔伯塔省的牧场上，一种牛羊致命出血的新疾病几乎同时在这些地区蔓延。当牧民对牛羊做一些不足以威胁其生命的常见操作(如割角或阉割)时，牛羊很容易因伤口无法凝结而出血并最终死亡。兽医弗兰克施菲尔德和罗德里克进行了调查，并得出结论，无论是病原生物还是营养不良都不是导致疾病的原因，其根源可追溯到发霉的草木樨。因此，这种疾病在兽医界被命名为“草木樨病”(又称甜苜蓿病)。当这种疾病第一次被发现时，动物病理学和人类医学在某种意义上没有可比性。牛羊食用这种变质的三叶草，15天左右凝血功能逐渐下降，30-50天后内出血死亡。
施菲尔德和罗德里克经过验证后得出结论，这种疾病是可逆的！通过在饲养过程中抽出这种发霉的干草，再用从正常牛羊身上抽出的新鲜血液进行输血，这些患病的牛羊就不会再有出血性外渗了。即使是病入膏肓的牛羊，在输血和喂好干草后，也有痊愈的希望。
Roderick在对病毒和生理学进行了一系列复杂而深入的研究后，于1931年强调凝血延迟或消失的原因是凝血剂的缺乏，凝血剂的量或活性的降低伴随着严重的出血性疾病。他根据美国伟大的凝血先驱教授开发的方法进行了这项研究。他利用豪威尔的丙酮法，通过沉淀正常牛类动物的血浆来制备凝血素，然后加入“草木樨血”来促进凝血。相比之下，“草木樨血”平行配制的凝固剂是不能凝固的。其他成分(纤维蛋白原、钙、血小板和抑制剂等。)当时已知维持正常凝血功能不受影响。
我第一次知道牛的草木樨出血性疾病是在1932年12月，当时明尼苏达大学生物化学系主任罗斯a戈特纳给我发了一封电子邮件，让我去圣保罗考虑这件事。因为“草木樨病”在明尼苏达州也是一个未解决的问题，如果我选择接受，这个项目会被研究。戈特纳给我提供了罗德里克的原始材料。在戈特纳的生化部门，许多人试图提取凝血剂，但像罗德里克等人一样，他们都失败了。
1933年1月，我们团队“正式”开始研究草木樨病，但与我们合作的遗传系教授、教授的研发方向不同。他们寻求开发一种草木樨品种，香豆素，它更适合或不受威斯康星州气候的影响。虽然香豆素闻起来很香，但吃起来很苦。通过对比实验发现，牛或兔子一开始更愿意吃苦味较少的植物。
农场悲剧
且不说“正式”研究中涉及的口感问题，我们实验室的第一次直接催化碰撞来自农业实践。
那是1933年2月的一个周六下午，屋外暴风雪呼啸，气温徘徊在0摄氏度。与布林克第一次见面后，一个陌生人闯入了实验室。埃德卡尔森是威斯康星州迪尔帕克的一个农民，离麦迪逊将近190英里，他带着教授后来称之为“证据”的东西。“草木樨病”在他的农场猖獗。他之前用干草喂牛没有问题，但现在他对兽医的诊断持怀疑态度。有人建议他去农业实验站寻求真相。此时，国家兽医办公室已经关闭。他来到生化楼纯属巧合。
艾德卡尔森的证据是一头死了的小母牛，一罐完全没有凝血功能的血，还有大约100磅发霉的草木樨——他唯一能喂牛的干草。他描述的整个发病过程完全符合“草木樨中毒”的典型画面。12月底，他失去了两头小母牛。一月份，他最喜欢的一只老牛发现自己的大腿上有一个很大的血肿，然后皮肤脓包迅速出血致命。最后两头小牛死于周五，而他的公牛正从鼻子里流血。因此，他冒着暴风雪来到麦迪逊。
我必须马上告诉艾德卡尔森，目前，我们能做的就是罗德里克和施菲尔德教授的建议：如果他想拯救它们，就必须停止给它们喂干草，如果可能的话，给这些病牛输血。将来可能会有有效的措施来避免这种疾病，但不是现在。下午四点，我看着他离开。从我们的实验室到他的农场的190英里的蜿蜒道路对他来说就像一个危险而黑暗的海洋。
我不能花时间讲述关于双香豆素故事的所有细节，但我向你保证，它对我的影响很大。当埃德卡尔森来看我们时，我的学生肖费尔(Schoeffel)是一个反复无常的斯瓦比亚人，他于1926年来到美国获得农业化学文凭，在实验室里目睹了这一切。在芝加哥畜牧场当了两年学徒后，他于1929年开始和我一起学习。Schoeffel是一个有趣、充满活力、忠诚的人，有时很神秘，他的日常对话经常引用歌德的《浮士德》、莎士比亚和《圣经》。埃德卡尔森离开时，朔伊费尔怒骂着，在实验室里来回咆哮：“天哪，一个农民开着一辆小破车在暴风雪中挣扎了近200英里，然后被告知没有其他办法，并被承诺也许有效的措施可能会在未来出现，五年、十年、十五年，或者永远不会出现！谁知道呢？喂好干草——输血！哦，天啊，没钱能怎么办？”他反复把手伸进牛奶罐，喃喃自语：“血，血。他回家后会发现什么？病牛。然后明天他和他的女人会去教堂祈祷，祈祷，再祈祷。星期一怎么样？更多的死牛！他不能吃好干草——他吃不起。如果他失去了所有的牛，上帝！哦，天啊！我们应该阻止死亡。”
我们直到晚上7点才把血和干草放好。当我离开实验室回家时，Schoeffel抓住我的肩膀，看着我的脸说，“在你走之前，我想告诉你一些事情。我会清理干净，星期一早上给你一份文件。”
生物鉴定研发
我们面临的基本问题：目前的出血试剂没有化学标准，所以提供小实验动物(兔子)进行生物鉴定，意味着通过测试干草和提取制备来评估抗凝血活性。
罗德里克之前的文献讲得很清楚：草木樨病是可逆的！食用腐烂的干草(甚至长期食用腐烂的干草)不会导致肝脏出现永久性的功能变异、明显的形态变化或可检测到的病理变异。据推测，肝脏是合成血栓烷的主要场所。然而，开发一种可行而简单的生物测定法的前景是未知的，就像牛的内部一样黑暗。我们在复杂的凝血问题上没有任何经验。
Schoeffel和Roberts首先指出Howell教授评价血栓烷活性的方法不能满足准确性的要求。Smith和Roberts指出，全凝血时间变量太大，检测全血浆的“快速1步法”需要改进。同时，史密斯指出，在给不同的兔子喂食标准剂量的50g变质干草时，反应变量也非常大。因此，坎贝尔和史密斯培育了一组易感兔进行生物学鉴定。
在1935-1938年期间，凝血专家之间发生了一场血腥而有趣的激烈争论：如何评价“凝血剂的浓度或活性”——应该使用豪厄尔教授发展的“快速1步法”还是他的合作者发展的“2步法”。我们尽量置身事外。1938年，坎贝尔终于克服了最重要的障碍，他用“快速1步法”检测了浓度为12.5%-8.34%的稀释血浆的凝血性。他在喂食任何制剂前24-36小时快速分析兔子，抽血后快速进行血浆凝固试验，并将每只兔子的试验血浆与正常血浆进行比较，以消除一些内部日常变量。通过使用单一的标准兔，并根据现有的生物变异问题采取严格的评估，差异将大大减少。而我们的目标是制备一种可以消除牛血中凝血的物质。血浆凝固的1步生物测定法需要改变，那些有评估价值的兔子也在评估过程中死亡。其中一只名叫贝丝坎贝尔的兔子在五年的时间里被用于200次个体评估。
双香豆素的离析、结晶 、鉴定、合成
从1933年2月那个决定命运的星期六到1939年6月，史密斯、罗伯兹和坎贝尔进行了一项漫长而艰苦的跟踪研究，研究的抗凝剂就陈列在他们的工作台上。我更愿意阐述变质草木樨中存在的一些化学物质的提取、分离和隔离问题。这种干草确实是生化杂质，产生很多不活跃的产物，有些是新产品，大部分是老产品。但是，现在还不足以声称这一热切的希望没有实现。出血试剂偶尔出现，像蓟种子的冠毛一样在我们面前盘旋，像鬼火一样避开我们。曾被认为是类叶绿素物质——脱镁叶绿素。
1939年6月28日，在黎明前的黑暗中，经过一整夜的战斗，坎贝尔终于在显微镜载玻片上看到了双香豆素的晶体。两个小时后，他收集了大约6克晶体。当我早上到达实验室时，坎贝尔正在沙发上睡觉，门由切特博伊尔斯把守。博伊尔斯是坎贝尔和一名实验助理。他是一名优秀的驯兽师。当我走进房间时，博伊尔斯正从上层的一个装有95%乙醇的瓶子里啜饮一口。他眨也不眨地对我说：“医生，我在庆祝。坎皮得奖了！”博伊尔斯的猜测这次是正确的。坎贝尔已经获得了双香豆素，确定其抗凝血潜力的首次生物测定也正在进行中。但是坎贝尔直到两天后拿到评估结果才向我汇报。
坎贝尔是一个不善于表达感情的人，但这次他却像一个第一次钓到大鱼的小男孩一样暗自高兴。他把药瓶递给我：“这是！(是出血试剂实验室的缩写)”。我不能透露博伊尔斯向我吐露过。我告诉坎贝尔，有两首德国诗歌非常适合这个时刻：
我们给Schoeffel发了一封短电报，他在芝加哥的美国药物协会管理实验室。他立即回复了200字的电报，明确表示完全信任我们。我们立即开始材料分离，收集了大约1800克抗凝血剂晶体。检测其结构的问题由一位敏感而有才华的人处理，他以丰富的想象力做出了正确的结构诊断，如3，3'-二苯基膦甲烷(4-羟基香豆素)。1940年4月愚人节日，他把目光定格在了合成路线上。合成和天然产品显示出相同的化学性质。随后，Overman和Sullivan在对兔子、大鼠、豚鼠、小鼠和狗进行仔细测试后，证明了天然和合成产品具有相同的生物特性。
4-羟基香豆素的3-取代衍生物的结构检测表明，由于处理不当，普通而苦涩的三叶草正在从新鲜的青草中渗出到干草中，这主要是基于香豆素分子。在变质的生化过程中，香豆素被氧化成4-羟基香豆素，然后与甲醛结合生成双香豆素。
双香豆素的生理作用
双香豆素大量合成后，需要快速建立其生理功能。实验表明，根据其形状和剂量，低凝血酶原血的强度和持续时间(凝血时间)会发生变化，从而产生反应滞后。用特定的单一剂量水平测试每个物种将获得最有效的反应。低于这个剂量水平，有效性的影响将下降到临界点，而高于这个剂量水平，药物将被完全吸收。
由于药物起效前有12-24小时的潜伏期或滞后期，后续的反复实施会产生累积效应。可以预见，在临床试验中，这种效果会因个体而异，当剂量个体化时，会获得最佳的治疗效果而不出血。
总结：
1.兔子、大鼠、豚鼠、小鼠、狗、猫、鸡的反应因物种差异而不同，这种差异会随着每个个体的年龄和敏感程度而不同。广义来说，大鼠和小鼠最敏感，其次是猫和狗，兔子、牛和鸡最不敏感。
2.饮食中维生素K和C的水平不仅影响抗凝的强度，也影响持续时间。
3.动物的营养状况会影响抗凝反应——所有种群在禁食时都会增强这种反应。
4.任何现有的低凝血酶原血，水杨酸(阿司匹林)、磺胺类药物或轻度氯仿麻醉诱导的反应均可增强。
5.肝肾功能也会影响反应的强度和持续时间。
6.目前，有影响肝脏的整体功能性药物，如甲基黄嘌呤和洋地黄，它们会产生轻微但明显可检测到的副作用。
7.孕妇或哺乳期妇女会对药物的抗凝作用产生轻微的抵抗。
这些观察没有涵盖影响双香豆素作用的所有条件，但涵盖了最基本的要点。最后，我要感谢多伦多的贝斯特医生团队，威斯康星总医院的戴尔、雅克和迈耶，以及其他所有确定血栓形成和血液中凝血机制之间存在最基本关系的人。这些研究首次明确了双香豆素能有效减少血管外和血管内血栓形成，同时降低低凝血状态。
打破惯性思维模式
当我们在1940年至1942年向临床医生提交双香豆素时，我们团队建立的一个重要点在开始时被遗漏，实际上被拒绝。我已经提到，第一个因素是维生素K可以抵消双香豆素的作用。我已经在我的信件、私人谈话、在梅奥诊所和威斯康星总医院的第一次双香豆素讲座中强调了这一点。然而，第一份临床报告支持的观点是“维生素K作为双香豆素的解毒剂是无效的。”这些药学期刊的编辑和注释作者只是通过“思考”和“不尝试”来天真地重申这些观点。作为凝血方面的权威，一位临床医生在1942年出版的一本书中错误地指出，“当双香豆素耗尽凝血酶原浓缩物时，维生素K无法修复它。”
这些最初的否认让我很不开心。不幸的是，被指责错误并不是不快乐的主要原因，因为我们确信维生素K的解毒功能在适当的时候会得到临床上的支持。真正困扰我的是双香豆素被污名化：这是一种危险的药物！这已经发生了。科学的特性吸引了我“真理必胜”纽约的一线临床医生Shepard Shapiro博士在1942年2月支持了我们的论断，即当肝功能正常时，维生素K可以抵消双香豆素在人体内的抗凝血作用。现在普遍认为水溶性维生素K或口服维生素K1可以解毒双香豆素过量。
首先，我们来调查一下为什么会产生这个错误。坎贝尔为我们的实验开发的动物具有良好的灵敏度，但临床医生尚未将该动物用作一级凝血评估。他们只在梗阻性黄疸、胆瘘、胆汁淤积等疾病中使用维生素K作为初级治疗，还认为维生素K的甲萘醌形式可能是有毒的。从临床实践中彻底消除这种错误观念需要十年时间。
综上所述，猜测和错误的思维阻止了维生素K成为双香豆素疗法的基石。
热情—困惑—合并
在成功合成双香豆素后的两年内，我们实验室制备了100多个相关的3-取代4-羟基香豆素衍生物，合成的步伐明显领先于生化评价。因此，在1944年1月我在哈维学会的演讲《来自变质的草木樨干草的抗凝血剂》中，我表示：“用兔子来评价相关活性并不能有效地推断双香豆素是最适合临床应用的化合物”。“在评估和测试许多化合物的过程中，发现其中一些化合物表现出缓慢但持续时间较长的低凝血酶原功能，而另一些化合物的低凝血酶原功能持续时间较短。在做出最终判断之前，我们需要花更多的时间来继续这个项目。从实验中获得的药物试剂需要在各种条件下最终在人体中测试低凝血酶原功能。结果可能无法预料。因此，正如我们所看到的，我们应该现在就开始这方面的研究，而不是结束它。”
作为一个农学家，我对预测一点信心都没有。从1941年到1944年，大约有50篇关于双香豆素临床应用的报道。任何新药的生产都会有一个有趣的循环事件，双香豆素很快就通过这个循环。报告的第一阶段表明乐观的气氛开始占上风。他们在《柳叶刀》(1941年9月13日)上发表了一篇题为“肝素及其竞争者”的社论。然后，第二阶段，迷茫阶段，把以双香豆素为抗凝剂的治疗分成了两个群体——狂热派和怀疑派。一些怀疑论者毫无理由地谴责这种药物，尽管他们提供了许多猜测、错误和无凝血酶原凝血时间测量。然后第三阶段——合并，最后得出结论，需要找到比双香豆素更好的抗凝剂。
1945年9月初，我厌倦了实验室的工作，和家人一起去划独木舟。在这次旅行中，我们遇到了一场寒冷的暴雨，我被浸泡在其中，我筋疲力尽。两周后，我得了胸膜炎。一开始我的医生以为我得了肺炎，后来我告诉他我以前得过肺结核，所以诊断成了复发性肺结核。我在威斯康星综合医院住了两个月，然后转到湖景疗养院。我在那里什么都不做，身体休息了六个月，每天吃鱼肝油，喝三瓶啤酒。然而这些并没有让我变得更强，反而让我得了老年肺结核。期间研究了实验记录，看了从古至今我心未萎的灭鼠史。
香豆素家庭中的Janus(古罗马的两面神)
我建议把临床上没用的“牛毒”转换成“杀鼠剂”，通过口服给药比较理想。从1940年到1944年，根据它们的化学结构，许多香豆素被合成。1945年至1946年我在疗养院时，实验室的工作几乎处于停顿状态。实验室只有几个学生，因为大部分留在部队。所以我有足够的时间查看所有的生化鉴定数据。直到1946年春天我从部队回来，我给他分配了重新评估化合物40-65抗凝血特性的任务。这些化合物是由Ikawa在1942-1943年制备的。舍尔不仅用兔子做生物鉴定，还用大鼠、小鼠和狗做实验。在1946-1948年期间，他定义了香豆素化合物42和63，并明确表示，当在小鼠和狗身上测试时，它们比双香豆素更好，并能产生更均匀的抗凝血反应。同时，还考虑一些特定的化学性质：可达到的纯度、制备它们的成本以及将它们转化成稳定的水溶性盐的性质。
早在1940-1942年，Overman，Field和我的同事们已经研究了双香豆素对实验小鼠的各种影响，以及饮食影响，特别是维生素K和食物的影响。1942年底，在Schoeffel的帮助下，我亲自进行了一次野外试验，以确定双香豆素在灭鼠中的适用性。结论是双香豆素不足以控制啮齿动物。因为主要的成熟谷物和绿色食品中含有丰富的维生素K，由于食物中含有维生素K，一只老鼠每天服用2毫克双香豆素就可以存活60天。如果在日常饮食中加入5毫克维生素K，实验鼠可以存活60天以上。
1942年初，我告诉谢尔和多萝西吴，应该用42号化合物来灭鼠。这个建议震惊了整个实验室，我断定他们的一致意见是“老板这次真的疯了”。舍尔赞成63号，它们有相似的化学性质。化合物63是42的直接衍生物。简而言之，1942年初，在威斯康辛校友研究基金会(WARF)能干、热情、热心公益的总经理沃德罗斯的赞助下，42号化合物被推广用于灭鼠。短时间内，这一努力彻底改变了灭鼠艺术(多剂量)，华法林迅速成为灭鼠领域的佼佼者。华法林这个名字是我发明的，是威斯康辛校友研究基金会的首字母缩写，从香豆素中提取的“Arin”——现在已经成为全世界家喻户晓的词。
1948-1952年，双香豆素家族研究在欧洲如火如荼。“模仿是最真诚的形式。”其中一种，双香豆素的衍生物，商品名特罗美生，早在1940年就没有被我们认真考虑过。虽然它比双香豆素起效更快，但需要更大的剂量才能达到同样的抗凝效果。另一个商品名是Marcumar，它与华法林非常接近，我们也跳过了它，因为它的钠盐比华法林钠盐水溶性差。Marcumar比华法林更有效，持续时间更长，但鉴于临床医生正在寻求的大数据，我更看重的是，作为一种抗凝剂，它应该以任何方式使用，以保留双香豆素的优势，而不是其局限性。
基于华法林对小鼠的反应是非常可靠的指标的假设，多少剂量对人体有反应？1950年底，我告诉医生和医生，水溶性华法林钠盐可以尝试用于人体治疗。临床医生如何看待在人体试验中使用杀鼠剂？1941年，临床医生从我们这里一字不差地抓住了“牛毒”来定义华法林，并将其转化为原始物质。他们真正热心接受的是用来杀老鼠的。然而，1950年4月5日，我们收到了费城海军上校的通知。一名预备役士兵在海军医院承认，他按照说明书连续五天服用大剂量华法林灭鼠。显然，华法林不足以让他摆脱这尘世的羁绊。同时，可能思考的时间太长了——最后，他去了医院。经过输血和大剂量维生素K治疗，这名预备役士兵顺利康复。
这一事件起到了催化剂的作用。Shapiro博士和Meyer博士从他们细致的工作中推断出华法林钠盐具有某种特性，这种特性在他们研究的双香豆素和其他抗凝剂中没有发现。柯林施罗德优化了华法林钠盐的制备工艺后，商品名为香豆定钠(香豆素钠)，我说服了老朋友Dr。从得到的临床报告来看，华法林钠克服了双香豆素的缺点，其效果是双香豆素的5-10倍。到目前为止，这是唯一一种可以口服、静脉注射、肌肉注射和直肠给药的化学合成抗凝剂。其他双香豆素类抗凝剂没有这些优势。一旦过量，可以很容易地用维生素k纠正。在日常使用中，华法林钠比双香豆素起效更快，需要的凝血时间更少。引用Shapiro博士和Meyer的话来说，它“在临床上非常容易处理”。基于其在各种情况下的出色表现，我确信华法林钠将取代双香豆素。
下面这个三角形可以形象地展示维生素K-双香豆素凝血疗法-临床判断的关系。k、凝血评价和临床判断分别为三个点，每个点与其他点相连。每一点都不是孤立的，而是与其他两点紧密相关的。尽管有良好的临床判断和准确的凝血时间，但维生素K的点仍然可能被诱发，因为每个患者本质上都是一个“非标准的生物实体”，医疗服务会产生剂量误差，患者可能出现轻微溃疡，或者肝肾功能在不知不觉中成为半影。
1955年9月29日，我收到了威斯康辛州一位前同事的名片，他现在在丹佛的菲茨西蒙陆军医院工作。卡片上写着：“总统(艾森豪威尔)正在用你的一种药。不是双香豆素。”第二天，这位发言人宣布：“原本用作抗凝剂的肝素已经被一种双香豆素取代，目前的凝血水平维持得非常好。”我知道Pollock上校的论文《华法林(香豆素钠盐)的临床试验》，看过1955年6月4日亚特兰大美国血管学会第一届年会的资料。我猜世界上最重要的人正在接受华法林钠的抗凝治疗。这个猜测得到了证实，华法林钠被总统使用已经成为公开的秘密。
临床上使用华法林的主要问题是剂量和凝血时间，凝血时间由于使用了凝血酶原激酶而发生了很大的变化。它比英国使用的凝血酶原激酶更敏感，出血并发症更少。后来，人们认识到，如果从患者身上获得的样本和由两种不同的凝血酶原激酶获得的凝固时间或凝固速率在双对数图上彼此成一直线。基于这一事实，1982年，世界卫生组织(世卫组织)正式采用一种模型，将任何试剂的凝血率换算成国际标准比(INR)，即如果使用一种国际参考制剂(IRP)，就可以得到凝血率。如果国际参考制剂的凝血率为y轴，实验制剂的凝血率为x轴，则其对角线为国际敏感指数(ISI)。这个控制抗凝剂的系统标准全世界都有。
最后，我想说，在过去的几十年里，我的实验室所取得的成果是许多学生共同努力的结果。记录或描述这次成功的冒险是非常有趣的。用艾伦格雷格(Allan Gregg)的话说，我的学生表现出了极大的“应急能力”。我认为他们成功的三大秘诀：他们永远保持好奇心，他们会一次又一次地尝试，他们在进行项目时，指向的是让人类变得更好，而不是试图毁灭人类。
参考资料：
1、流通。1959 (19):97-107，双香豆素及其衍生物的发现
2、英国血液学杂志，2008，141，757-763，肝素和华法林发现的故事